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Chip/Co-IP/Chip-seq的準備工作

更新時間:2023-03-07點擊次數:3053
  Chip/Co-IP/Chip-seq的準備工作:
 
  預冷PBS,RIPA Buffer,細胞刮子(用保鮮膜包好后,埋冰下),離心機
 
  1. 用預冷的PBS洗滌細胞兩次,后一次吸干PBS;
 
  2. 加入預冷的RIPA Buffer(1ml/107個細胞、10cm培養(yǎng)皿或150cm2培養(yǎng)瓶,0.5ml/5×106個細胞、6cm培養(yǎng)皿、75cm2培養(yǎng)瓶)
 
  3. 用預冷的細胞刮子將細胞從培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶上刮下,把懸液轉到1.5EP管中,4℃,緩慢晃動15min(EP管插冰上,置水平搖床上)
 
  4. 4℃,14000g離心15min,立即將上清轉移到一個新的離心管中
 
  5. 準備Protein A agarose,用PBS 洗兩遍珠子,然后用PBS配制成50%濃度,建議減掉槍尖部分,避免在涉及瓊脂糖珠的操作中破壞瓊脂糖珠
 
  6. 每1ml總蛋白中加入100μl Protein A瓊脂糖珠(50%),4℃搖晃10min(EP管插冰上,置水平搖床上),以去除非特異性雜蛋白,降低背景
 
  7. 4℃,14000g離心15min,將上清轉移到一個新的離心管中,去除Protein A珠子
 
  8. (Bradford 法)做蛋白標準曲線,測定蛋白濃度,測前將總蛋白至少稀釋1:10倍以上,以減少細胞裂解液中去垢劑的影響(定量,分裝后,可以在-20℃保存一個月)
 
  9. 用PBS將總蛋白稀釋到約1 μg/μl,以降低裂解液中去垢劑的濃度,如果興趣蛋白在細胞中含量較低,則總蛋白濃度應該稍高(如10 μg/μl)
 
  10. 加入體積的兔抗到500μl總蛋白中,抗體的稀釋比例因興趣蛋白在不同細胞系中的多少而異
 
  11. 4℃緩慢搖動抗原抗體混合物過夜或室溫2h,激酶或磷酸酯酶活性分析建議用2 h室溫孵育
 
  12. 加入100μl Protein A瓊脂糖珠來捕捉抗原抗體復合物,4℃緩慢搖動抗原抗體混合物過夜或室溫1h,如果所用抗體為鼠抗或雞抗,建議加2 μl"過渡抗體"(兔抗鼠IgG,兔抗雞IgG)
 
  13. 14000rpm瞬時離心5s,收集瓊脂糖珠-抗原抗體復合物,去上清,用預冷的RIPA buffer洗3遍,800μl/遍,RIPA buffer有時候會破壞瓊脂糖珠-抗原抗體復合物內部的結合,可以使用PBS
 
  14. 用60μl 2×上樣緩沖液將瓊脂糖珠-抗原抗體復合物懸起,輕輕混勻,緩沖液的量依據上樣多少的需要而定(60 μl足夠上三道)
 
  15. 將上樣樣品煮5min,以游離抗原,抗體,珠子,離心,將上清電泳,收集剩余瓊脂糖珠,上清也可以暫時凍-20℃,留待以后電泳,電泳前應再次煮5min變性。
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